Матеріали для Нової української школи 1 клас - планування, розробки уроків, дидактичні та методичні матеріали, підручники та зошити

БІОЛОГІЯ - Золота колекція рефератів - 2018

ЗАГАЛЬНА БІОЛОГІЯ

МЕТОДИ СЕЛЕКЦІЇ БАКТЕРІЙ

Мікроскопічні методи дослідження й з’ясування способів розселення й розмноження бактерій дали можливість розробляти нові й найбільш раціональні методи їхньої селекції, прийоми використання в господарській діяльності людини (очищення води, одержання антибіотиків, вітамінів, амінокислот, білків та ін.).

Засновником наукової селекції мікроорганізмів (бактерій, грибів, деяких одноклітинних еукаріотів), що грунтується на свідомому застосуванні методичного штучного відбору й умілому використанні природного добору, можна вважати французького вченого Луї Пастера (1822 -1895).

Подальша селекція бактерій пов’язана з досягненнями генетики й використанням цих досягнень у селекції. Ще Г. А. Надсон 1920 р. показав, що іонізувальна радіація викликає в грибів і бактерій стійкі спадкові зміни. Таким шляхом він виділив в Azotobacter chroococcum штами, які вирізнялися підвищеною здатністю асимілювати атмосферний азот.

Сьогодні в селекції бактерій існують три основні напрямки:

1. Підвищення стійкості до отрут, антибіотиків і зниження вимог до складу поживного середовища.

2. Підвищення нагромадження корисних речовин.

3. Підвищення вимог до ростових речовин.

У селекції бактерій широко застосовуються штучний мутагенез, використовуються плазміди, схрещування штамів за допомогою вірусів-бактеріофагів, генна й клітинна інженерії. Методи селекції мікробів постійно вдосконалюються.

Прокаріоти мають у селекції ряд переваг: вони швидко розмножуються, у багатьох з них невідомий статевий процес, тому метод гібридизації не застосовується. Кільцем ДНК дає можливість проявлятися мутаціям уже в першому поколінні нащадків.

Перша гібридна молекула ДНК була отримана Поло Бергом 1972 р. Вона складалася з фрагмента ДНК бахтеріофага кишкової палички (групи генів, відповідальних за зброджування цукру галактози) і повної ДНК вірусу SV40 (викликає розвиток пухлин у мавп). Теоретично така структура могла мати функціональну активність у клітинах як кишкової палички, так і мавпи. За цю роботу 1980 р. П. Бергу була присуджена Нобелівська премія.

Після Берга вчені різних країн створили in vitro (у склянці, штучно) безліч функціонально активних гібридних ДНК. Суть цього методу генної інженерії полягала у введенні в геном клітини нового гена.

Найпоширенішим методом є метод конструювання й перенесення рекомбінантних ДНК. Він включає шість етапів.

І етап. Полягає в створенні вектора для перенесення нового гена. Вектор — це молекула ДНК (або РНК), яка здатна самостійно реплікуватися в клітинах і забезпечувати розмноження й роботу вбудованого в неї гена. Вектор звичайно не має власних регуляторних елементів. Як вектори використовують ДНК плазмід і бактеріофагів.

Плазміди — це кільцеві дволанцюжкові молекули ДНК, широко розповсюджені в природі. Їхні розміри — від 2-3 до декількох десятків тисяч пар нуклеотидів. Вони є автономними генетичними елементами, які здатні легко проникати з однієї бактеріальної клітини в іншу й реплікуватися незалежно від основної молекули ДНК клітини прокаріотів.

Плазміди можуть нести життєво важливі для бактерії гени (наприклад, гени стійкості до антибіотиків). Чимало плазмід містять гени, що дозволяють засвоювати новий субстрат; гени, що сприяють стійкості до дезінфікувальних засобів; гени, що визначають синтез токсичних для людини речовин. Наприклад, сама по собі дифтерійна паличка не становить небезпеки для людини. Може викликати легке ангіноподібне захворювання. Однак її плазміда містить геп, що відповідає за синтез дифтерійного токсину. Дифтерійний токсин — це небезпечна для людини отрута білкової природи.

Одержують плазмідну ДНК із клітин бактерій. Відокремлюють від бактеріальної шляхом центрифугування в градієнті концентрації.

Як вектор можна використовувати бактеріофаги. Від них одержують великі фрагменти ДНК (на відміну від плазмід). Для цього найчастіше використовується фаг лямбда (фаг кишкової палички). Він має відносно невелику ДНК, гени якої добре вивчені. Фаг швидко розмножується в клітинах бактерій. Може втратити до 25 % своєї ДНК і не втратити здатності формувати зрілі фагові частки, руйнувати бактеріальні клітини. При більших втратах фаг гине. Фаг здатний також включати будь-яку чужу ДНК, довжина якої відповідає його власній або трохи перевищує її (так, щоб вона розмістилася в білковій оболонці фага). У такий спосіб удалося одержати різні фрагменти хромосом кишкової палички (а також інших організмів) у складі фага.

II етап. Необхідний для одержання гена, щоб вмонтувати його у вектор. Для цього використовуються різні методи: штучний синтез гена, за допомогою ферменту зворотної транскриптази одержання копії гена на іРНК, метод «дробовика». Одержав ген індійський учений Г. Коран, який працював у США. Це був ген однієї із тРНК, що містить 77 нуклеотидних пар. Ген збирався з окремих блоків. Пізніше були розроблені автоматичні синтезатори олігонуклеотидів.

Гени штучно синтезують із дезоксирибонуклеотидів. Перший синтетичний геп отриманий наприкінці 60-х — на початку 70-х рр.

За допомогою методу «дробовика» молекула ДНК розділяється спеціальними ферментами (рестриктазами). Потім відшукується потрібний її фрагмент, у якому міститься потрібний ген. Відкрив рестриктази 1970 р. швейцарський учений Вернер Арбер. Бактеріальні клітини виділяють цей фермент для руйнування сторонньої (наприклад, фагової) ДНК. Рестриктази звичайно розпізнають у ДНК короткі специфічні ділянки, довжина яких складає 4-6 нар нуклеотидів (тобто сайти — ділянки дізнавання). Ферменти розділяють обидва ланцюги ДНК посередині (або з деяким зміщенням) таких ділянок.

Рестриктази можуть розділяти ДНК бактерій, вірусів, рослин або тварин. Головною умовою є наявність пізнаваних ділянок (сайтів). Сьогодні відомо більше декількох сотень рестриктаз.

Першими застосували ці ферменти для одержання необхідних генів 1972 р. американські вчені Стенді Коен і Герберт Бойєр. Складнішим завданням є знаходження потрібного гена в молекулі ДНК. Розділяють потрібні ділянки за допомогою методу електрофорезу в холодцеподібному середовищі (гелі). Метод розробив американський учений Даиієль Натане, за що одержав Нобелівську премію. Він склав повну фізичну карту розташування ділянок для 14 рестриктаз ДНК вірусу SV40. Електрофорез дозволяє, виділити фрагменти в чистому вигляді.

Деякі молекули ДНК не несуть фрагментів, пізнаваних рестриктазами. Тому застосовують інші методи, один із яких — цілеспрямоване одержання потрібного гена. Це стало можливим після відкриття (незалежно один від одного) американськими вірусологами Хауардом Теміним і Девідом Балтімором нового методу 1970 р., за що вони були визнані гідними Нобелівської премії. Учені вивчали онкогенні РНК-вмісні віруси й довели можливість перенесення спадкової інформації від РНК до ДНК (метод зворотної транскрипції). Для одержання потрібного гена необхідно з клітини донора виділити іРНК, що є його транскрипційною копією. Зворотна транскрипція здійснюється ферментом РНК-залежної ДНК-полімеразою (зворотною транскриптазою, або ревертазою). Використовується іРНК ферментом як матриця для синтезу комплементарної нитки ДНК. Утворюється двониткова молекула РНК-ДНК. Спеціальними ферментами іРНК знищується. Ланцюг ДНК, що залишився, слугує матрицею для синтезу другого ланцюга ДНК. Ця ДНК відповідає тільки тій частині гена, що кодує його білковий продукт. У фрагменті відсутні регуляторні ділянки гена. Приєднання регуляторних елементів різних організмів викликає функціонування гена. Введення фрагмента в клітини бактерій дозволяє одержати клони, що містять тільки обраний ген.

III етап. Необхідний для вбудовування отриманого гена у вектор. Отримані фрагменти донорної ДНК, що містять потрібний ген, мають кіпці з нуклеотидами, комплементарними до нуклеотид вектора. Тому вектор і фрагмент ДНК з потрібним геном з’єднуються. Цей процес називається реструкцією. Зовні рекомбінантна ДНК не відрізняється від звичайної.

IV етап. Полягає у введенні рекомбінантної ДНК у клітину бактерій. Введення рекомбінантної ДНК у клітину-реципієнт називається трансформацією. Звичайно з цією метою використовуються кишкові палички (Е. соlі), тому що добре живуть і розмножуються. Для генної інженерії отриманий навіть спеціальний штам кишкової палички, що виживає тільки в особливих лабораторних умовах і нездатний заразити людину. Для введення необхідно, щоб мембрана бактеріальної клітини стала на певний час проникною для нової молекули ДНК. У клітині бактерій модифікована ДНК зможе розмножуватися.

V етап. Оскільки рекомбінантна ДНК проникає не в усі клітини бактерій, необхідний відбір потрібних клітин. Для цього використовується метод селективних середовищ. Бактерії при цьому висівають у поживне холодцеподібне середовище з необхідною речовиною (наприклад, токсином, антибіотиком та ін.). Нетрансформовані бактерії гинуть, а трансформовані залишаються живими й утворюють колонію —клон.

VI етап. Має місце, якщо па попередніх етапах використовувався метод «дробовика». Бактеріальні клітини утворюють багато колоній, які містять різні фрагменти ДНК. Відбір бактерій з потрібним геном називається скринінгом. Для цього колонії бактерій накривають спеціальним фільтром. У результаті частина колоній залишається на фільтрі, причому положення колоній збігатиметься. Фільтр обробляється рядом речовин, які руйнують клітини й вивільняють ДНК. Потім використовують радіоактивний зонд, за допомогою якого розпізнають необхідні ДНК. Потрібний ген у ДНК, зв’язавшись із зондом, несе радіоактивну мітку. Положення на плівці засвічених ділянок, які утворилися через радіоактивну мітку, дозволяє знайти клон з рекомбінантною ДНК із потрібним геном.

У наш час бактерії широко використовуються в мікробіологічній промисловості. Вони є основними виробниками багатьох антибіотиків, вітамінів, лимонної кислоти, ферментів, кормових білків тощо. Удосконалення процесів біотехнології за допомогою одержання й використання високопродуктивних штамів мікроорганізмів дозволяє з меншими витратами одержати більшу кількість якісної продукції.









загрузка...